Existen discrepancias en cuanto a sus orígenes y su formación, pero parece seguro que se formó con Cimabue, en cuya tradición iconográfica se inscriben algunas de sus creaciones, como el Crucifijo de Santa Maria Novella, donde la figura de Cristo está dotada de un sentido humano más profundo que en su maestro. La obra más antigua que se le atribuye son los frescos de la iglesia superior de Asís, en concreto la Historia de san Francisco, si bien esta atribución constituye uno de los problemas más debatidos de la historia del arte. Está documentada con seguridad la presencia de Giotto en Asís hacia 1290, pero existen demasiadas diferencias estilísticas entre esta obra y otras asignadas con seguridad al maestro.
Giotto se trasladó más tarde a Padua para pintar los frescos que la familia Scrovegni le encargó en una capilla de su propiedad. Son los únicos que se asignan con certeza al maestro. Incluyen un Juicio Final (muro oeste), una Anunciación (arco del presbiterio) y escenas de la Vida de la Virgen y de la Pasión de Cristo (muros restantes), bajo los cuales figuran personificaciones de virtudes y vicios pintadas en grisalla con objeto de crear efectos de relieve.
La obra en su conjunto denota una nueva concepción de la pintura por la atención que presta el artista tanto a la creación de efectos de perspectiva como a la unificación del espacio, que acierta a integrar las figuras con los elementos arquitectónicos que les sirven de marco. Realza la solemnidad y el dramatismo que impregnan estas escenas el empleo de colores puros y matizados.
